Найти и обезвредить: главные методы выявления вирусов

Назвал Михаил Лебедев, ведущий эксперт CMD Центрального НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, и рассказал об этапах открытия вирусов.

Знакомство с вирусами

Во второй половине XIX века ученые доказали, что инфекционные заболевания человека и животных вызываются микробами. Этот термин появился в мировом лексиконе в 1878 году и обозначал недавно открытую группу живых организмов, которые были слишком малы для того, чтобы увидеть их невооруженным глазом. Микробами тогда считались исключительно бактерии. Для установления прямой связи конкретной бактерии с определенным инфекционным заболеванием проводилась световая микроскопия, культуральные исследования (выращивание в питательных средах). Кроме того, бактерии можно было осаждать – они не проходили через специальный керамический фильтр.

В 1892 году российский ученый Дмитрий Иосифович Ивановский изучал мозаичную болезнь табака. Изначально он предположил, что причина болезни – бактерия, и планировал осадить ее на керамическом фильтре, затем выделить в культуру и повторно заразить здоровое растение. Но в процессе работы Ивановский выяснил, что болезнь вызывается каким-то неизвестным, невидимым в световой микроскоп, инфекционным агентом, не оседающим на фильтре и не растущим в питательных средах. Однако этот неведомый возбудитель оказался чувствительным к действию антисептиков. Свои наблюдения Дмитрий Ивановский опубликовал в 1892 году в «Бюллетене Санкт-Петербургской Императорской Академии наук».

В 1898 году голландский микробиолог Мартин Виллем Бейеринк также исследовал мозаичную болезнь табака – он воспроизвел результаты Дмитрия Ивановского, признавая его первенство, и провел ряд дополнительных тестов. Бейеринк пришел к выводу, что имеет дело вовсе не с микробом-бактерией, а с фильтрующейся «молекулой», которая заразна, патогенна и способна размножаться в организме растения. В 1899 году именно Бейеринк предложил для обозначения этого «инфекционного начала» использовать термин «вирус» (от латинского virus – яд). При этом Бейеринк ошибочно полагал, что вирус представляет собой жидкую материю, а не частицы. Таким образом, первым был открыт вирус растений.

В 1898 году Фридрих Леффлер и Пауль Фрош выяснили, что вирусам подвержены и животные, – они исследовали ящур, распространенную болезнь крупного рогатого скота. В 1901 году Уолтер Рид и Джеймс Кэрролл обнаружили, что инфекционные агенты можно выделить и из трупов людей, умерших от желтой лихорадки. Так были открыты вирусы человека. А в 1915–1917 годах Феликс Д’Эррель и Фредерик Туорт обнаружили вирусы у бактерий. Д’Эррель назвал их «пожирателями бактерий» или «бактериофагами».

В 1935 году Уэнделл Мередит Стэнли впервые выделил чистый препарат вируса табачной мозаики в кристаллическом виде, тем самым доказав, что вирусы – это частицы, а не жидкая субстанция. 

В 1931 году Эрнст Руска и Макс Кнолль построили первый прототип просвечивающего электронного микроскопа, а в 1939 году на рынок поступил первый в мире коммерческий массовый электронный микроскоп с разрешающей способностью в 100 ангстремов. Теперь вирусы можно было увидеть! За свою работу Эрнст Руска в 1986 году был награжден Нобелевской премией по физике.

Так были заложены основы новой научной дисциплины – вирусологии, бурному развитию которой в дальнейшем способствовали новые методы исследования.

Как исследуют вирусы

В 1949 году Джон Эндерс, Томас Уэллер и Фредерик Роббинс разработали метод культивирования вирусов в клеточной культуре, что позволило изучать их в лабораторных условиях.

В 1950–1960-е годы началось активное развитие молекулярно-биологических и генетических методов. Было установлено, что у вирусов в генетическом материале присутствует только один тип нуклеиновой кислоты: либо дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), либо рибонуклеиновая кислота (РНК), были открыты ключевые ферменты.

В 1983 году американский биохимик Кэри Муллис изобрел метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), в 1985 году вышла первая научная публикация на эту тему. Метод ПЦР произвел настоящую революцию в молекулярной биологии и медицине. В 1993 году за свое открытие Муллис был удостоен Нобелевской премии по химии.

В настоящее время ПЦР и ее модификации считаются «золотым стандартом» диагностики вирусных инфекций. ПЦР в реальном времени (RT-PCR) позволяет не только обнаружить вирус, но и определить его количество (вирусную нагрузку), что критически важно для оценки эффективности лечения и определения прогноза многих вирусных инфекций (ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты). Мультиплексная ПЦР может выявить в одной пробирке сразу несколько возбудителей. Это необходимо для диагностики вирусных инфекций, когда схожие симптомы могут вызывать различные вирусы (ОРВИ, острые кишечные инфекции). 

Секвенирование нового поколения (NGS) – высокопроизводительные методы определения последовательности нуклеотидов в ДНК/РНК вируса, позволяющие одновременно «прочитать» миллионы коротких фрагментов генетического материала. Если ПЦР ищет заранее известный «кусочек» генетического материала, то NGS дает возможность увидеть всю генетическую последовательность вируса. С помощью NGS возможно обнаружить совершенно новые, неизвестные науке вирусы, осуществлять контроль за мутациями известных патогенов (вирусов гриппа, SARS-CoV-2), изучать устойчивость вирусов к лекарствам.

Иммунологические методы диагностики вирусных инфекций выявляют не сам вирус, а реакцию организма на него – антитела (иммуноглобулины) или антигены (белки вируса). При исследовании возможно не только выявить наличие антител-иммуноглобулинов, но также определить их количество и класс (ранние IgM, поздние IgG, секреторные IgA), что позволяет назвать стадию развития инфекции.

В наши дни лабораторная диагностика вирусных инфекций – комплекс методов, направленных на выявление возбудителей инфекций или признаков их присутствия в организме. Быстрая и точная диагностика – ключ к эффективному лечению, контролю над эпидемиологической ситуацией и распространением инфекционных заболеваний.

Больше полезной информации по санитарной безопасности и профилактике опасных заболеваний на сайте санщит.рус.